Радислав Наков, Венцислав Наков, Ваня Герова, Людмила Танкова; Клиника по гастроентерология, УМБАЛ „Царица Йоанна – ИСУЛ“, Медицински университет – София

За контакт с авторите:  Д-р Радислав Наков, дм; ул. „Бяло море“ 8; Клиника по гастроентерология, УМБАЛ „Царица Йоанна – ИСУЛ“; Тел, 0889807559; Email: radislav.nakov@gmail.com

Абстракт

Въведение: Фекалният калпротектин (ФКП) често се използва за мониториране на възпалителната активност и предсказване на релапса при възпалителните чревни (заболявания (ВЧЗ). Поставихме си за цел да оценим полезността на ФКП като маркер за активност при пациенти с ВЧЗ.

Методи: Това проспективно проучване включва  121 пациенти (76 с болест на Крон – БК и 45 с улцерозен колит – УК) наочени за колоноскопия към нашия център. ФКП е изследван във фекални проби чрез имунохроматографския метод  Quantum Blue®

Резултати: Средните стойности на ФКП  при пациентите с колонна и илеоколонна БК бяха сигнификантно по-високи, отколкото при пациентите с тънкочревна БК (<0,001) и БК в ремисия (<0,001). Средните ФКП стойности при БК в ремисия бяха по-високи, отколкото при контролите  (р=0,001). Пациентите с активна тънкочревна БК имаха сигнификантно по-високи стойности на ФКП, отколкото при тези в ремисия (<0,001).  Гранична стойност на ФКП от 315 μg/g предсказва мукозно възпаление при пациенти с БК с 94 % чувствителност и 98% специфичност. Нямаше сигнификантна разлика между средните ФКП нива на контролите и пациентите с УК в ремисия (р=0,205). Средните ФКП нива при пациентите с активен УК бяха сигнификантно по-високи, отколкото при контролите (p<0,001) и при пациентите в ремисия (p<0,001).

Заключение: ФКП е отличен маркер за оценка на активността при болест на Крон и улцерозен колит. ФКП може да бъде полезен и за предсказване на мукозното оздравяване. Също така бързият Quantum Blue тест позволява по-лесна оценка на ФКП в клиничната практика.

Ключови думи: фекален калпротектин, възпалителни чревни заболявания, мукозно оздравяване.

Въведение

Възпалителните чревни заболявания (ВЧЗ), които включват болестта на Крон (БК) и улцерозния колит (УК), са хронични идиопатични възпалителни заболявания, засягащи гастроинтестиналният тракт.

В клиничната практика от съществено значение е да се детерминира болестната активност и да се постигне мукозно оздравяване (МО), което от своя страна е свързано с достигането на продължителна ремисия и намален риск от операция при ВЧЗ [1, 2]. За да оценят активността, лекарите разчитат на комбинация от клинични и ендоскопски методи, както и на лабораторни биомаркери [3].

По настоящем „златен стандарт“ за оценка на мястото, разпространението и тежестта на интестиналното възпаление е ендоскопията с биопсия [4]. Ендоскопските процедури, обаче, са инвазивни, с потенциален риск от усложнения [5]. Подобни процедури могат да бъдат болезнени и често изискват обща анествзия, което води до допълнителни рискове за пациента. Почистването на дебелото черво преди колоноскопия е неприятно и може да бъде рисково в дадени ситуации [6].

От друга страна, симптоматиката не може достоверно да отрази разпространението на възпалението и отговора към терапията, а също така има ограничена корелация с ендоскопската активност [7]. Именно затова, за оценка на болестната активност в клиничната пркатика се използва комбинация от клинични, лабораторни, ендоскопски и микроскопски изследвания [8].

Редица лабораторни маркери са проучени за мониториране на ендоскопската активност при ВЧЗ [9]. При тези заболявания, активното възпаление е асоциирано с остро-фазова реакция и миграция на левкоцити към чревния лумен. По този начин могат да бъдат измерени повишени стойности на няколко белтъка в серум и фецес. Осто-фазовите реактанти (СУЕ, левкоцити, CRP) демонстрират ниски чувствителнсот и специфичност по отношение на активността на интестиналното възпаление [10, 11].

Фекалните маркери и по-специално фекалният калпротектин (ФКП) са по-чувствителни при оценка на чревното възпаление [12]. Калпротектинът е малък, калции-свързващ протеи, изграден от две тежки и една лека полипептидни вериги. Открива се в излишък в неутрофилните гранулоцити, където съставлява 60% от цитозолната фракция, открива се и в моноцитите и макрофаките [13]. ФКП е често използван биомаркер за мониториране активността на ВЧЗ [14]. Също така, повишените стойности на ФКП биха могли да предсказват релапс при ВЧЗ [15].

В настоящето проучване си поставихме за цел да оценим ФКП като маркер за оценка на активността при болест на Крон и улцерозен колит

Методи

Дизайн, включващи и изключващи критерии

Това проспективно проучване тип „случай-контрол“ включва 121 пациенти с ВЧЗ – 65 жени, 56 мъже на средна възраст 39,8 ± 9 (19-68) насочени за колоноскопия към Клиниката по гастроентерология на УМБАЛ „Царица Йоанна – ИСУЛ“, София в периода Май 2014 – Април 2016.

Включихме само пациенти, отговарящи на включващите и изключващите критерии. Включващите критерии бяха:  (1) възраст 18–85 години, (2) известна диагноза УК или БК, диагностицирана според критериите на ECCO [16, 17] (3) попълнено информирано съгласие.

Изключващи критерии: (1) колоректален карцином и полипи, (2) некласифицируем колит, (3) история за колоректална хирургия, (4) инконтиненция на урина (поради риск от контаминация на фекалните проби), (5) бременност, (6) прием нанестероидни вротивовъзпалителни средства (НСПВС) – 2 таблетки/седмично, (7) прием на орални стероиди, стероидни клизми или стартиране на азатиоприм в последните 3 мвсеца, (8) инфекциозен колит и (9) първичен имунодефицит.

Като клинична ремисия при УК дефинирахме Lichtiger Clinical Activity Index от 3 или по-малко точки [18], а за ендоскопска ремисия – Ulcerative Colitis Endoscopic Index of Severity (UCEIS) с 0 или 1 точка, само ако тази точка е по отношение на съдовия рисунък [19]. Клиничната ремисия при БК е определена като Crohn`s disease activity index (CDAI) <150, а ендоскопската ремисия като липса на лигавични изменения (ерозии, язви и афти) при илеоколоноскопия.

При всички пациенти е извършена илеоколоноскопия. Индикациите за колоноскопия са били клинично активна болест (релапс), оценка на болестната активност след лечение, наличие на неясна симптоматика и проследяване за дисплазия.

Фекалните проби са събрани 1-2 дни преди колоноскопията. Стойностите на ФКП са изследвани при всички пациенти и при 18 здрави доброволци, приети за контролна група.

Фекален калпротектин. ФКП е изследван чрез бърз количествен тест, като е използван point-of-care desk-top Quantum Blue Reader® (POC Reader) метод. Това е имунохроматографски метод базиран на ELISA (Фигура 1). Всички тестове са проведени съгласно инструкциите на производителя  (Quantum Blue® Calprotectin, Bühlmann Laboratories AG, Switzerland)  [20]. Quantum Blue® измерва стойности на ФКП в диапазона 30-300 μg/g. При получаване на стойности >300 μg/g, се извършваше допълнително разреждане 1:10 с екстракционен буфер, според инструкциите на производителя, което позволи получаване на стойности на ФКП до 3000 μg/g. Стойностите на ФКП над горната граница бяха регистрирани като 3000 µg/g, а стойностите под долната граница – като 30 µg/g.

 

 

Статистически анализ. Статистически анализ е извършен чрез SPSSS, версия 25.0. (SPSS Inc., Chicago, USA). За анализ на данните са използвани следните статистически методи: дескриптивна статистика, Kolmogorov-Smirnov тест, Shapiro-Wilk тест, Mann-Whitney тест и ROC (Receiver operating characteristic) curve анализ – за определяне на гранична стойност на количествени променливи. Получените резултати са приети като статистически значими при p<0.05.

Eтически норми. Изследването е одобрено от етичната комисия на УМБАЛ „Царица Йоанна – ИСУЛ“. Преди началото на проучването информирано съгласие е подписано от всички пациенти и контроли. Проучването отговаря на етичните изисквания от Декларацията от Хелзинки 1975 (6-та ревизия, 2008).

Резултати

76 пациенти с БК, 45 с УК и 18 здрави контроли (група 1) са включени в това проучване. 41 от пациенти с БК са в ремисия (група 2), 18 с активност и локализация в илеума – L1 (група 3) и 17 с активност с колонна или илео-колонна локализация (група 4). Двадесет от пациентите с УК са в ремисия и 25 са с активност.

При сравнителен анализ се установи, че стойностите на ФКП на пациентите с БК в ремисия са значимо по-високи, в сравнение със съответните при здравите контроли (p=0,001). Статистически значима разлика е налице и между средните стойности на  ФКП на здравите контроли (група 1), спрямо съответните стойности при пациентите с БК – от група 3 (р<0,001), група 4 (<0,001) и група 3 & 4 (<0,001). Установяваме значима разлика и при сравняване на стойностите на ФКП на пациентите от група 2, с тези от група 3 (<0,001), група 4 (<0,001) и група 3 & 4 (<0,001). Освен това, нивата на ФКП на пациентите с изолирана тънкочревна БК (L1) се различават значимо от съответните стойности на пациентите от подгрупата с дебелочревна (L2) и с илеоколонна (L3) локализация (<0,001) (Таблица 1, Фигура 2).

Таблица 1. Стойности на ФКП при здрави контроли, пациенти с БК в ремисия, пациенти с БК в активност с локализация в илеума, пациенти с БК в активност с колонна или илео-колонна локализация и общо при пациентите с БК в активност.

Група	N	Mean	SD	Median	Min	Max
Група 1 (здрави контроли)	18	34,72	7,43	31,00	30,00	58,00
Група 2 (БК в ремисия)	41	97,12	85,48	60,00	30,00	360,00
Група 3 (БК в активност L1)	18	958,44	694,25	800,00	136,00	3000,00
Група 4 ( БК в активност L2 и L3)	17	2143,35	882,29	2150,00	247,00	3000,00
Група 3 & Група 4	35	1533,97	984,05	1460,00	136,00	3000,00

 

Установихме, че гранична стойност (cut-off) на ФКП от 315 μg/g разграничава пациентите с БК в ремисия от тези с активност в илеума с 94 % чувствителност, 98 % специфичност и AUC 0,984 (Фигура 3) и от тези с БК в активност, независимо от локализацията със същата чувствителност (94%) и специфичност (98%) при AUC 0,989 (Фигура 4).

 

При сравнителен анализ не се установи статистически значима разлика между средните

 стойностите на ФКП на здравите контроли (34,72 µg/g) и тези, на пациентите с УК в ремисия (47,10 µg/g) (р=0,205). Но пациентите с УК в активност (1933,08 µg/g) имат значимо по-високи средни стойности на ФКП, както в сравнение с тези на здравите контроли (34,72 µg/g), (p<0,001), така и в сравнение с подгрупата пациенти в ремисия (47,10 µg/g), (p<0,001) (Таблица 2; Фигура 5).

Таблица 2. Стойности на ФКП при здрави контроли, пациенти с УК в ремисия и пациенти с УК в активност.

Група	N	Mean	SD	Median	Min	Max
Група 1 (контроли)	18	34,72	7,43	31,00	30,00	58,00
Група 2 (УК в ремисия)	20	47,10	26,91	36,50	30,00	136,00
Група 3 (УК в активност)	25	1933,08	940,98	2010,00	450,00	3000,00

 

Обсъждане

Към момента в световната медицинска литература са натрупани достатъчно факти, демонстриращи връзката между стойностите на ФКП и тежестта на чревното възпаление при ВЧЗ. Именно затова, изследването на ФКП за определяне на ремисия и активност, както и за мониториране на терапевтичния отговор при тези болни е от съществено значение. Основната цел на съвременното лечение на пациентите с ВЧЗ е не просто подобряването на симптоматиката, но и постигане на мукозно оздравяване (МО) [21].

Поради това, че честите ендоскопски изследвания са скъпи, трудоемки и неприятни за пациентите, все по-често като алтернатива за оценка на МО се използва ФКП. Към момента, са извършени само няколко малки изследвания по темата.

Roseth и сътр. извършили колоноскопия с биопсия на 45 пациенти с IBD в клинична ремисия и установили, че 38 от тях имат, както нормални стойности на ФКП, така и нормална хистология [22]. Lamb и сътр. съобщават, че пациентите с ВЧЗ, при които ремисията (клинична и ендоскопска) е потвърдена и хистологично, имат стойности на ФКП, близки до тези на здравите контроли [23]. Това доказва наличието на МО. Затова той прави заключението, че ФКП може да се приеме като сурогатен маркер на МО [22].

В настоящото проучване не намираме статистически значима разлика между нивата на ФКП при здравите контроли и пациентите с УК в ремисия и така потвърждаваме наличието на МО. В обширно проучване на Schoepefer и сътр. средната стойност на ФКП при пациентите с УК в ремисия е 42.0 μg/g, което е много близко до получените от нас резултати 47,10 μg/g [24].  Подобни резултати получават и други автори. При част от пациентите с неактивен УК е възможно наличие на нискостепенно чревно възпаление, при което стойностите на ФКП са по-високи от нормата, но обикновено не надхвърлят 150 μg/g. В съответствие с тези предположения, в нашата група пациенти с УК в ремисия най-високата стойност на ФКП е 136 μg/g.

В същото време стойностите на ФКП при пациентите с активен УК са статистически по-високи от тези на здравите контроли и пациентите в ремисия. Поради липса на засичане на резултатите на ФКП между пациентите с активен УК и УК в ремисия нямаше как да се отдиференцира ясен cut-off между активност и ремисия при УК.

Средните стойности на ФКП при пациентите с БК в ремисия са 97,12 μg/g, което е сигнификантно по-високо от съответните стойности при здравите контроли 34,72 μg/g (р=0,001).  Подобно, стойностите на ФКП при пациентите с активна БК, независимо от локализацията, са сигнификантно по-високи от тези при БК в ремисия (р<0,001). Установихме, че стойности на ФКП под 315 μg/g предсказват ремисия, а в случая и МО, с 94% чувствителност и 98% специфичност. Подобни резултати демонстрират и други автори. D’Haens и колеги докладват, че при пациенти с БК, стойности на ФКП под 250 μg/g предсказват МО с 94% чувствителност, 62% специфичност, PPV – 48% и NPV – 96% [25].

Получените резултати показват, че ФКП може да бъде използван като лесен и удобен маркер за отдиференциране на ремисия от активност при ВЧЗ, както и да се приеме като сурогатен маркер за МО.

Установени са и различни стойности на ФКП в зависимост от фенотипната изява (възпалителна, стриктурираща, пенетрираща) на БК [26]. Някои автори смятат, че нивата на ФКП могат да зависят не само от вида болест, но и от органната локализация при БК [27], но данните по този въпрос са все още недостатъчни и противоречиви. В настоящето проучване демонстрирахме, че стойностите на ФКП при пациентите с колонна или илеоколонна локализация са значимо по-високи от тези на пациентите с локализация в илеума (р<0,001), като от своя страна последните са значително по-високи от тези на пациентите с БК в ремисия (р<0,001).

Въпреки, че един от най-често цитираните недостатъци на ФКП е свързан с понижената му диагностична стойност при пациенти с тънкочревна БК, в изследването ни стойностите на ФКП на всички пациенти с активна БК и локализация L1 бяха повишени. Още повече, цитираната вече гранична стойност (cut-off) от 315 μg/g с еднаква чувствителност (94%) и специфичност (98%) разграничава пациенти в ремисия от такива с активна тънкочревна БК или активна БК, независимо от локализацията.

Всичко описано до тук са малко или много известни факти, имащи нужда от допълнителни и по-обширни проучвания, за да навлязат още по-усилено в ежедневната клинична практика. Най-голямата сила на тази част от разработката ни е, че това е едно от първите описания на голяма кохорта пациенти с ВЧЗ, изследвани с имунохроматографския метод Quantum Blue. Получените данни са напълно еднопосочни с получените при изследване с ELISA, като е доказано, че тестът може да служи като надеждна алтернатива на ELISA [28, 29]. Считаме, че методът Quantum Blue е много полезен, поради това, че е лесен за изпълнение, може да бъде извършен във всеки лекарски кабинет или буквално до леглото на болния и е наистина бърз (резултатите се получават за по малко от 30 мин, вкл. и екстракцията на белтъка). Друго основно предимство на теста е простотата на приготвяне на пробите и анализа на резултатите. Не повече от 80 mg фекална проба са нужни за изследването, а анализът е лесен за изпълнение и не изисква специално оборудване, което прави тестът идеален за всяка лаборатория и лекарски кабинет. Доказано е, че Quantum Blue® е инструмента на избор за бързо и надеждно определяне на стойностите на ФКП [29].

Заключение

В заключение, ФКП е отличен маркер за оценка на активността при болест на Крон и улцерозен колит. ФКП може да бъде полезен и за предсказване на мукозното оздравяване. Следователно, ФКП има потенциала да измести колоноскопията при проследяването на пациенти с ВЧЗ. Също така бързият Quantum Blue тест позволява по-лесна оценка на ФКП в клиничната практика.

За контакт с авторите:

Д-р Радислав Наков, дм; ул. „Бяло море“ 8; Клиника по гастроентерология, УМБАЛ „Царица Йоанна – ИСУЛ“; Тел, 0889807559; Email: radislav.nakov@gmail.com

 

Библиография:

1. Sandborn WJ, Feagan BG, Stoinov S, Honiball PJ, Rutgeerts P, Mason D, et al. Certolizumab pegol for the treatment of Crohn’s disease. N Engl J Med 2007; 357: 228–238.
2. Sakuraba A, Annunziata ML, Cohen RD, Hanauer SB, Rubin DT. Mucosal healing is associated with improved long-term outcome of maintenance therapy with natalizumab in Crohn’s disease. Inflamm Bowel Dis 2013;19:2577–2583.
3. Fefferman DS, Farrell RJ. Endoscopy in inflammatory bowel disease: indications, surveillance, and use in clinical practice. Clin Gastroenterol Hepatol: the official clinical practice journal of the American Gastroenterological Association 2005; 3: 11–24.
4. Konikoff MR, Denson LA. Role of fecal calprotectin as a biomarker of intestinal inflammation in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis 2006; 12: 524-534
5. Limburg PJ, Ahlquist DA, Sandborn WJ, Mahoney DW, Devens ME, Harrington JJ, Zinsmeister AR. Fecal calprotectin levels predict colorectal inflammation among patients with chronic diarrhea referred for colonoscopy. Am J Gastroenterol 2000; 95: 2831–2837
6. Paduchova Z, Durackova Z. Fecal calprotectin as a promising marker of inflammatory diseases. Bratisl Lek Listy 2009; 110: 598-602
7. Schoepfer AM, Beglinger C, Straumann A, Trummler M, Renzulli P, Seibold F. Ulcerative colitis: correlation of the Rachmilewitz endoscopic activity index with fecal calprotectin, clinical activity, C-reactive protein, and blood leukocytes. Inflamm Bowel Dis 2009; 15: 1851–1858.
8. Nikolaus S, Schreiber S. Diagnostics of inflammatory bowel disease. Gastroenterology 2007; 133:1670–1689.
9. Zauber AG. Cost-effectiveness of colonoscopy. Gastrointest Endosc Clin N Am 2010; 20: 751–770.
10. Sipponen T, Savilahti E, Kolho KL, Nuutinen H, Turunen U, Färkkilä M. Crohn’s disease activity assessed by fecal calprotectin and lactoferrin: correlation with Crohn’s disease activity index and endoscopic findings. Inflamm Bowel Dis 2008; 14:40–6.
11. Langhorst J, Elsenbruch S, Mueller T, Rueffer A, Spahn G, Michalsen A, et al. Comparison of 4 neutrophil-derived proteins in feces as indicators of disease activity in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis 2005; 11: 1085–1091.
12. Vermeire S, Van Assche G, Rutgeerts P. Laboratory markers in IBD: useful, magic, or unnecessary toys? Gut 2006; 55: 426–31.
13. Bjerke K, Halstensen T, Jahnsen F, Pulford K, Brandtzaeg P. Distribution of macrophages and granulocytes expressing L1Protein (calprotectin) in human Peyer’s patches compared with normal ileal lamina propria and mesenteric lymph nodes. Gut 1993; 34: 1357–1363.
14. Lewis JD. The utility of biomarkers in the diagnosis and therapy of inflammatory bowel disease. Gastroenterolgy 2011; 140: 1817–1826.e2.
15. Tibble JA, Sightorsson G, Bridger S, et al. Surrogate markers of intestinal inflammation are predictive of relapse in patients with inflammatory bowel disease. Gastroenterology 2000; 119: 15–22.
16. Magro F, Gionchetti P, Eliakim R, et al. Third European Evidence-based Consensus on Diagnosis and Management of Ulcerative Colitis. Part 1: Definitions, Diagnosis, Extra-intestinal Manifestations, Pregnancy, Cancer Surveillance, Surgery, and Ileo-anal Pouch Disorders. J Crohns Colitis. 2017 Jun 1;11(6):649-670.
17. Gomollón F, Dignass A, Annese V, et al. 3rd European Evidence-based Consensus on the Diagnosis and Management of Crohn’s Disease 2016: Part 1: Diagnosis and Medical Management. J Crohns Colitis. 2017 Jan;11(1):3-25.
18. Lichtiger S, Present DH, Kornbluth A, et al. Cyclosporine in severe ulcerative colitis refractory to steroid therapy. N Engl J Med 1994; 330: 1841–1845.
19. Travis SP, Schnell D, Krzeski P, Abreu MT, Altman DG, Colombel JF, et al. Developing an instrument to assess the endoscopic severity of ulcerative colitis: the Ulcerative Colitis Endoscopic Index of Severity (UCEIS). Gut 2012; 61: 535–42.
20. Quantum Blue® Calprotectin Normal Range Quantitative Lateral Flow Assay LF-CAL20 package insert (2010-11-10).
21. Fefferman DS, Farrell RJ. Endoscopy in inflammatory bowel disease: indications, surveillance, and use in clinical practice. Clin Gastroenterol Hepatol, 2005; 3(1): 11–24.
22. Roseth AG, Aadland E, Grzyb K. Normalization of faecal calprotectin: a predictor of mucosal healing in patients with inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol 2004;39:1017–1020.
23. Lamb CA, Mohiuddin MK, Gicquel J et al. Faecal calprotectin or lactoferrin can identify postoperative recurrence in Crohn’s disease. Br J Surg. 2009, 96, 663–674
24. Schoepfer A, Trummler M, Seeholzer P, et al. Discriminating IBD from IBS: comparison of the test performance of fecal markers, blood leukocytes, CRP, and IBD antibodies. Inflamm Bowel Dis. 2008;14:32–39.
25. D’Haens G, Ferrante M, Vermeire S, et al. Fecal calprotectin is a surrogate marker for endoscopic lesions in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis 2012;18:2218–2224.
26. Vieira A, Fang CB, Rolim EG, Klug WA, Steinwurz F, Rossini LG, Candelária PA. Inflammatory bowel disease activity assessed by fecal calprotectin and lactoferrin: correlation with laboratory parameters, clinical, endoscopic and histological indexes. BMC Res Notes. 2009; 2: 221.
27. Damms A, Bischoff SC. Validation and clinical significance of a new calprotectin rapid test for the diagnosis of gastrointestinal diseases. Int J Colorectal Dis, 2008, 23, 985–992.
28. Coorevits L, Baert FJ and Vanpoucke HJ. Faecal calprotectin: comparative study of the Quantum Blue rapid test and an established ELISA method. Clin Chem Lab Med 2013; 51: 825-31.
29. Sydora MJ, Sydora BC and Fedorak RN. Validation of a point-of-care desk top device to quantitate fecal calprotectin and distinguish inflammatory bowel disease from irritable bowel syndrome. J Crohns Colitis 2012; 6: 207-14.