Хидроксихлороквин и азитромицин като лечение на COVID-19: резултати от открито не-рандомизирано клинично изпитване

Gautret et al. (2020) Hydroxychloroquine and azithromycin as a treatment of COVID‐19: results of an open‐label non‐randomized clinical trial. International Journal of Antimicrobial Agents – In Press 17 March 2020 – DOI : 10.1016/j.ijantimicag.2020.105949


Philippe Gautreta, Jean-Christophe Lagiera, Philippe Parola, Van Thuan Hoang, Line Meddeb, Morgane Mailhe, Barbara Doudier, Johan Courjon , Valérie Giordanengo, Vera Esteves Vieira, Hervé Tissot Duponta, Stéphane Honoré, Philippe Colson, Eric Chabrière, Bernard La Scola, Jean-Marc Rolain, Philippe Brouqui, Didier Raoult; IHU-Méditerranée Infection, Marseille, France; Aix Marseille Univ, IRD, AP-HM, SSA, VITROME, Marseille, France;. Aix Marseille Univ, IRD, APHM, MEPHI, Marseille, France; Thai Binh University of Medicine and Pharmacy, Thai Binh, Viet Nam; Infectiologie, Hôpital de l’Archet, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Nice, France; Université Côte d’Azur, Nice, France; U1065, Centre Méditerranéen de Médecine Moléculaire, C3M, Virulence Microbienne et Signalisation Inflammatoire, INSERM, Nice, France; Department of Virology, Biological and Pathological Center, Centre Hospitalier; Universitaire de Nice, 06200 Nice, France; Service Pharmacie, Hôpital Timone, AP-HM, Marseille, France; Laboratoire de Pharmacie Clinique, Aix Marseille Université, Marseille, France.

Абстракт

Въведение: Установено е, че хлорохинът и хидроксихлороквинът са ефективни при SARS-CoV-2 и са докладвани за ефективни при китайски пациенти с COV-19. Ние оценяваме ролята на хидроксихлороквина върху респираторните вирусни натоварвания.

Пациенти и методи: Потвърдени пациенти с COVID-19 от Франция бяха включени в протокол с уеднаквено лечение от началото на март до 16 март, за да получават 600 mg хидроксихлороквин дневно и тяхното вирусно натоварване се тества ежедневно с назофаренгиален аспират в болнична обстановка. В зависимост от клиничните резултати към лечението се добавя азитромицин. Нелекуваните пациенти от друг център и случаите, отказващи протокола, бяха включени като отрицателни контроли. Наличието и отсъствието на вирус на ден 6 от включването се счита за крайна точка

Резултати: Шест пациенти са били безсимптомни, 22 са имали симптоми на инфекция на горните дихателни пътища, а осем са симптомите на инфекция на долните дихателни пътища. Двадесет случая са лекувани в това проучване и показват значително намаление на вирусните нива след шест-дневен в сравнение с контролните и много по-ниска средна продължителност на пренасяне от съобщените за нелекувани пациенти в литературата. Азитромицин, добавен към хидроксихлороквин, е значително по-ефективен за елиминиране на вируса.

Заключение: Въпреки малкия размер, нашето проучване показва, че лечението с хидроксихлороквин е значително свързано с намаляване/ изчезване на вирусния товар при пациенти с COVID-19 и неговият ефект се усилва от азитромицин.

1. Въведение

В края на декември 2019 г. огнище на нововъзникваща болест (COVID-19) поради нов коронавирус (наречен последно SARS-CoV-2) започна в Ухан, Китай и бързо се разпространи в Китай и извън него [1,2]. СЗО обяви епидемията от COVID-19 за пандемия на 12 март 2020 г. [3]

Според неотдавнашно китайско проучване около 80% от пациентите са с леко заболяване и общата степен на смъртност на случаите около 2,3%, но достига 8,0% при пациенти на възраст от 70 до 79 години и 14,8% при тези на възраст над 80 години [4]. Вероятно обаче има значителен брой асимптоматични носители в популацията и следователно смъртността вероятно е надценена. Сега Франция е изправена пред вълната COVID-19 с над 4 500 случая към 14 март 2020 г. [5]

Следователно, има спешна необходимост от ефективно лечение за лечение на симптоматични пациенти, но и за намаляване на продължителността на пренасяне на вируса, за да се ограничи предаването в общността. Сред лекарствата, потенциални за лечение на COVID-19, репозиционирането на стари лекарства за употреба като антивирусно лечение е интересна стратегия, тъй като знанията за профила на безопасност, страничните ефекти, дозировката и лекарствените взаимодействия са добре известни [6,7].

В скорошен доклад се посочва за инхибиторен ефект на Ремдезивир (ново антивирусно лекарство) и хлорохин (старо антималарийно лекарство) върху растежа на SARS-CoV-2 ин витро, [8] и ранно клинично изпитване, проведено при пациенти с COVID-19 в Китай , показаха, че хлорохинът има значителен ефект, както по отношение на клиничния резултат, така и върху вирусния клирънс, в сравнение с контролните групи [9,10]. Китайските експерти препоръчват пациентите, диагностицирани като леки, умерени и тежки случаи на пневмония COVID-19 и без противопоказания за хлорохин, да се лекуват с 500 mg хлорохин два пъти дневно в продължение на десет дни [11]. Доказано е, че хидроксихлороквинът (аналог на хлорохина) притежава антиSARS-CoV активност ин витро [12].

Клиничният профил на безопасност на Хидроксихлороквинът е по-добър от този на хлорохин (по време на дългосрочна употреба) и позволява по-висока дневна доза [13] и има по-малко възможности във връзка с лекарствени взаимодействия [14]. Нашият екип има много голям опит в успешното лечение на пациенти с хронични заболявания, дължащи се на вътреклетъчни бактерии (Ку-треска поради Coxiella burnetii и болест на Уипъл поради Tropheryma whipplei) с продължително лечение с хидроксихлороквин (600 mg/ден за 12 до 18 месеца), в продължение на повече от 20 години. [15,16]

Следователно ние започнахме да провеждаме клинично изпитване, насочено към оценка на ефекта на хидроксихлороквин върху пациенти, инфектирани с SARS-CoV-2, след одобрение от Министерството на здравеопазването на Франция. В този доклад описваме ранните си резултати, като се фокусираме върху вирусологичните данни при пациенти, получаващи хидроксихлороквин в сравнение с контролна група.

2.Методи
Това текущо проучване се координира от The Méditerranée Infection University Hospital Institute в Марсилия. Пациенти, на които беше предложено лечение с хидроксихлороквин, бяха избрани в болницата. Контролните без лечение с хидроксихлороквин са били избрани от центрове в Марсилия, Ница, Авиньон и Бриансон, всички разположени в Южна Франция.

Хоспитализирани пациенти с потвърден COVID-19 бяха включени в това проучване, ако отговарят на два основни критерия: i) възраст над 12 години; ii) PCR документиран преносител на SARS-CoV-2 в назофарингеална проба при постъпване, независимо от тяхното клинично състояние.

Пациенти бяха изключени, ако имат известна алергия към хидроксихлороквин или хлорохин или имат друго известно противопоказание за лечение с изследваното лекарство, включително ретинопатия, дефицит на G6PD и удължаване на QT-интервала. Кърмачките и бременните пациенти бяха изключени въз основа на декларацията и резултатите от тестовете за бременност, когато се налагаше.

Информирано съгласие

Преди да бъдат включени в проучването, пациентите, отговарящи на критериите за включване, трябваше да дадат съгласието си за участие в проучването. Писмено съгласие е получено от пълнолетни участници (> 18 години) или от родители или законни настойници за непълнолетни лица (<18 години).

На всеки пациент беше предоставен информационен документ, който ясно показва рисковете и ползите, свързани с участието в изследването. Пациентите получават информация за своето клинично състояние по време на грижите, независимо дали участват в проучването или не.

По отношение на идентифицирането на пациента, номер на изследването се определя последователно на включените участници, в съответствие с диапазона на пациентските номера, разпределени за всеки център за изследване. Изследването е проведено в съответствие с насоките на добрата клинична практика на Международния съвет за хармонизация на техническите изисквания за фармацевтични продукти за хуманна употреба (ICH), Хелзинкска декларация и приложимите стандартни оперативни процедури.

Протоколът, приложенията и всяка друга подходяща документация бяха представени на Френската национална агенция за безопасност на лекарствата (ANSM) (2020-000890-25) и на Френския комитет по етика (CPP Ile de France) (20.02.28.99113) за преглед и одобрени съответно на 5 и 6 март 2020 г. Това изпитване е регистрирано в Регистъра на клиничните изпитвания на ЕС, номер 2020-000890-25.

Процедура

Пациентите са били наблюдавани и ежедневно проследявани в продължение на 14 дни. Всеки ден пациентите получават стандартизиран клиничен преглед и, когато е възможно, се събира назофарингеална проба. Всички клинични данни бяха събрани с помощта на стандартизирани въпросници.

На всички пациенти в центъра в Марсилия беше предложено перорално хидроксихлороквин сулфат 200 mg три пъти на ден в продължение на десет дни (в тази предварителна фаза не сме записали деца в лечебната група въз основа на данни, показващи, че децата развиват леки симптоми на COVID-19 [4]).

Пациентите, които са отказали лечението или са имали критерий за изключване, са служили за контрол. Пациентите в други центрове не получават хидроксихлороквин и служат за контрол. Симптоматичното лечение и антибиотиците като мярка за предотвратяване на бактериална супер-инфекция бяха осигурени от изследователите въз основа на клинична преценка. Хидроксихлороквинът беше осигурен от Националната фармация на Франция при номинално търсене.

Клинична класификация

Пациентите бяха групирани в три категории: безсимптомни, с инфекция на горните дихателни пътища (URTI), когато се диагностицира с ринит, фарингит или изолирани нискостепенна треска и миалгия, както и с инфекции на долните дихателни пътища (LRTI), когато се проявяват със симптоми на пневмония или бронхит.

PCR (Полимеразната верижна реакция) анализ

SARS-CoV-2 РНК се оценява чрез PCR в реално време с обратна транскрипция [17].

Дозировка на хидроксихлороквин

Хидроксихлороквинът е дозиран от серумните проби на пациента чрез UHPLC-UV, използвайки предварително описан протокол [18]. Пикът на хроматограмата при задържане 1.05 минути съответства на хидроксихлороквинов метаболит.

Серумната концентрация на този метаболит се определя от абсорбцията на UV, както при концентрацията на хидроксихлороквин. Като се имат предвид и двете концентрации, се изчислява началната серумна хидроксихлороквинова концентрация.

Kултура

За всички пациенти, 500 µl от течността, събрана от назофарингеалния тампон, се пропуска през центробежен филтър с размер 0,22 µm (Merck Millipore, Дармщат, Германия), след което се инокулират в ямки от 96-гнездови културни микроплаки, от които 4 ямки съдържат Vero E6 клетки (ATCC CRL-1586) в среда с минимална есенциална средна култура с 4% фетален телешки серум и 1% глутамин.

След центрофугиране при 4000 g, микроплаките се инкубират при 37°С. Плаките се наблюдават ежедневно за доказателства за цитопатогенен ефект. Предполагаемото откриване на вирус в супернатанта се извършва с помощта на SU5000 SEM (Hitachi), след което се потвърждава от специфичен RT-PCR.

Крайни цели

Основна крайна точка е вирусологичен клирънс на 6-ия ден след включването. Вторичните резултати са вирусологичен клирънс по време на периода на изследване, клинични проследявания (телесна температура, дихателна честота, продължителност на престоя в болница и смъртност) и поява на странични ефекти.

Статистика
Ако приемем 50% ефективност на хидроксихлороквин за намаляване на вирусното натоварване на 7-ми ден, степен на грешка тип I от 5% и 10% загуба при проследяване, изчислихме, че общо 48 пациенти на COVID-19 ( т.е. за анализа са необходими 24 случая в хидроксихлороквиновата група и 24 в контролната група (Fleiss с CC).

Статистическите различия бяха оценени чрез Хи-квадрат тест на Пирсън или точните тестове на Фишер като категорични променливи, според случая. Средствата за количествени данни бяха сравнени с помощта на Student’s t-test. Анализите бяха извършени във Stata версия 14.2.

3. Резултати (подробни резултати са налични табл.1)

Демография и клинично представяне

Ние регистрирахме 36 от 42 пациенти, отговарящи на критериите за включване в това проучване, които са имали поне шест дни проследяване към момента на настоящия анализ. Общо 26 пациенти са получили хидроксихлороквин, а 16 са контролирани пациенти. Шест пациенти, лекувани с хидроксихлороквин, са загубени при проследяване по време на изследването поради ранно прекратяване на лечението.

Причините са следните: трима пациенти бяха прехвърлени в интензивно отделение, включително един прехвърлен на ден 2 след включване, който беше PCR-положителен в ден 1, един прехвърлен на ден 3 след включване, който беше PCR-положителен в дни 1-2 и един прехвърлен на ден 4 след включване, който беше PCR-позитивен на ден 1 и ден 3; един пациент почина в ден 3 след включването и беше PCR-отрицателен в ден 2; един пациент реши да напусне болницата в ден 3 след включването и е PCR-отрицателен в дни 1-2; един пациент спря лечението на ден 3 след включване поради гадене и беше PCR-позитивен в дните 1-2-3. Следователно резултатите, представени тук, са тези на 36 пациенти (20 пациенти, лекувани с хидроксихлороквин и 16 контролни пациенти).

Никой от контролните пациенти не е загубен при проследяване. Основните демографски данни и клиничното състояние са представени в табл.1. Общо 15 пациенти са мъже (41,7%), със средна възраст 45,1 години. Делът на асимптоматичните пациенти е 16,7%, този на пациенти със симптоми на инфекция на горните дихателни пътища е 61,1%, а този на пациенти със симптоми на инфекция на долните дихателни пътища е 22,2%.

Всички пациенти със симптомите на инфекция на долните дихателни пътища са потвърдили пневмония при компютърна томография. Пациентите, лекувани с хидроксихлороквин, са по-възрастни от контролните пациенти (51,2 години срещу 37,3 години). Не се наблюдава съществена разлика между лекуваните с хидроксихлороквин пациенти и контролните пациенти по отношение на пола, клиничния статус и продължителността на симптомите преди включването (табл. 1).

Сред пациентите, лекувани с хидроксихлороквин, шест пациенти са получавали азитромицин (500 mg на ден 1, последвано от 250 mg на ден през следващите четири дни), за да се предотврати бактериална суперинфекция под ежедневен контрол на електрокардиограмата.Клиничното проследяване и появата на нежелани реакции ще бъдат описани в следващ документ в края на проучването.

Дозировка на хидроксихлороквин

Средната концентрация на хидроксихлороквин в серума е 0,46 ug/ml+0,2 (N = 20).

Ефектът на хидроксихлороквин върху вирусния товар

Делът на пациентите, които имат отрицателни резултати от PCR в назофарингеалните проби, значително се различава между лекуваните пациенти и контролните групи на 3-4-5 и 6 дни след включване (Табл. 2).

На ден 6 след включването 70% от лекуваните с хидроксихлороквин пациенти са вирусологично излекувани в сравнение с 12,5% в контролната група (р = 0,001).

При сравняване на ефекта от лечението с хидроксихлороквин като единично лекарство и ефекта от комбинацията на хидроксихлороквин и азитромицин, делът на пациентите, които имат отрицателни резултати от PCR в назофарингеалните проби, е значително различен между двете групи на 3-4-5 и 6-ти ден след включване (табл. 3).

На ден 6 след включването 100% от пациентите, лекувани с хидроксихлороквин и комбинация от азитромицин, са вирусологично излекувани в сравнение с 57,1% при пациенти, лекувани само с хидроксихлороквин, и 12,5% в контролната група (р <0,001). Тези резултати са видни на фиг. 1 и 2.

Ефектът от лекарството е значително по-висок при пациенти със симптоми на инфекция на горните и долните дихателни пътища в сравнение с асимптоматични пациенти с р <0,05.

Трябва да се отбележи, че една пациентка, която все още е положителна за PCR при включване на ден 6 хидроксихлороквин, е получавала азитромицин в допълнение към хидроксихлороквин на ден 8 и е излекувала инфекцията си на ден 9.

За разлика от това, един от пациентите под хидроксихлороквин и комбинация от азитромицин, които са тествали отрицателно в ден 6, е тестван положителен с нисък титър на ден 8.

Култури

Бихме могли да изолираме SARS-CoV-2 в 19 от 25 клинични проби от пациенти.

Референции:
[1] Lai CC, Shih TP, Ko WC, Tang HJ, Hsueh PR. Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) and coronavirus disease-2019 (COVID-19): The epidemic and the challenges. Int J Antimicrob Agents. 2020 Feb 17:105924. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2020.105924. [Epub ahead of print]
[2] Wang LS, Wang YR, Ye DW, Liu QQ. A review of the 2019 Novel Coronavirus (COVID-19) based on current evidence”. Int J Antimicrob Agents. 2020 [Epub ahead of print]
[3] WHO Director-General’s opening remarks at the media briefing on COVID-19 – 11 March 2020. [https://www.who.int/dg/speeches/detail/who-director-general-s-opening-remarks-atthe-media-briefing-on-covid-19–11-march-2020]
[4] Wu Z, McGoogan JM. Characteristics of and important lessons from the coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak in China: summary of a report of 72 314 cases from the Chinese Center for Disease Control and Prevention. JAMA. 2020 Feb 24. doi: 10.1001/jama.2020.2648. [Epub ahead of print]
[5] Santé Publique France. Infection au nouveau Coronavirus (SARS-CoV-2), COVID-19, France et Monde [https://www.santepubliquefrance.fr/maladies-et-traumatismes/maladies-etinfections-respiratoires/infection-a-coronavirus/articles/infection-au-nouveau-coronavirussars-cov-2-covid-19-france-et-monde]
[6] Colson P, Rolain JM, Raoult D. Chloroquine for the 2019 novel coronavirus SARS-CoV2. Int J Antimicrob Agents. 2020 Feb 15:105923. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2020.105923. [Epub ahead of print]
[7] Colson P, Rolain JM, Lagier JC, Brouqui P, Raoult D. Chloroquine and hydroxychloroquine as available weapons to fight COVID-19. Int J Antimicrob Agents. 2020 [Epub ahead of print]
[8] Wang M, Cao R, Zhang L, Yang X, Liu J, Xu M, et al. Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus (2019-nCoV) in vitro. Cell Res 2020;10-0282.
[9] Gao J, Tian Z, Yang X. Breakthrough: Chloroquine phosphate has shown apparent efficacy in treatment of COVID-19 associated pneumonia in clinical studies. Biosci Trends 2020 Feb 19. doi: 10.5582/bst.2020.01047. [Epub ahead of print]
[10] Chinese Clinical Trial Registry.
[11] Multicenter collaboration group of Department of Science and Technology of Guangdong Province and Health Commission of Guangdong Province for chloroquine in the treatment of novel coronavirus pneumonia. Expert consensus on chloroquine phosphate for the treatment of novel coronavirus pneumonia]. Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2020 Mar 12;43(3):185-188. doi: 10.3760/cma.j.issn.1001-0939.2020.03.009
[12] Biot C, Daher W, Chavain N, Fandeur T, Khalife J, Dive D, et al. Design and synthesis of hydroxyferroquine derivatives with antimalarial and antiviral activities. J Med Chem 2006;49:2845-2849.
[13] Marmor MF, Kellner U, Lai TY, Melles RB, Mieler WF; American Academy of Ophthalmology. Recommendations on Screening for Chloroquine and Hydroxychloroquine Retinopathy (2016 Revision). Ophthalmology. 2016 Jun;123(6):1386-94. doi: 10.1016/j.ophtha.2016.01.058. Epub 2016 Mar 16.
[14] Yao X, Ye F, Zhang M, Cui C, Huang B, Niu P, et al. In Vitro Antiviral Activity and Projection of Optimized Dosing Design of Hydroxychloroquine for the Treatment of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Clin Infect Dis. 2020 Mar 9. pii: ciaa237. doi: 10.1093/cid/ciaa237. [Epub ahead of print]
[15] Raoult D, Houpikian P, Tissot Dupont H, Riss JM, Arditi-Djiane J, Brouqui P. Treatment of Q fever endocarditis: comparison of 2 regimens containing doxycycline and ofloxacin or hydroxychloroquine. Arch Intern Med. 1999 Jan 25;159(2):167-73.
[16] Lagier JC, Raoult D. Whipple’s disease and Tropheryma whipplei infections: when to suspect them and how to diagnose and treat them. Curr Opin Infect Dis. 2018 Dec;31(6):463-470.doi: 10.1097/QCO.0000000000000489. [x] Expert consensus on chloroquine phosphate for the treatment of novel coronavirus pneumonia. Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2020 Mar 12;43(3):185-188. doi: 10.3760/cma.j.issn.1001-0939.2020.03.009.
[17] Amrane S, Tissot-Dupont H, Doudier B, Eldin C, Hocquart M, Mailhe M et al. Rapid viral diagnosis and ambulatory management of suspected COVID-19 cases presenting at the infectious diseases referral hospital in Marseille, France, – January 31st to March 1st, 2020: A respiratory virus snapshot. Travel Med Infect Dis. 2020 [Epub ahead of print].
[18] Armstrong N, Richez M, Raoult D, Chabriere E. Simultaneous UHPLC-UV analysis of hydroxychloroquine, minocycline and doxycycline from serum samples for the therapeutic drug monitoring of Q fever and Whipple’s disease. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2017: 1060, 166-172.
[19] Zhou F, Yu T, Du R, Fan G, Liu Y, Liu Z, et al. Clinical course and risk factors for mortality of adult inpatients with COVID-19 in Wuhan, China: a retrospective cohort study. Lancet. 2020 Mar 11. pii: S0140-6736(20)30566-3. doi: 10.1016/S0140-6736(20)30566-3. [Epub ahead of print]
[20] Retallack H, Di Lullo E, Arias C, Knopp KA, Laurie MT, Sandoval-Espinosa C, et al. Zika virus cell tropism in the developing human brain and inhibition by azithromycin. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Dec 13;113(50):14408-14413. Epub 2016 Nov 29.
[21] Madrid PB, Panchal RG, Warren TK, Shurtleff AC, Endsley AN, Green CE, Kolokoltsov A, et al. Evaluation of Ebola Virus Inhibitors for Drug Repurposing. ACS Infect Dis. 2015 Jul 10;1(7):317-26. doi: 10.1021/acsinfecdis.5b00030. Epub 2015 May 11.
[22] Bosseboeuf E, Aubry M, Nhan T, de Pina, JJ, Rolain JM, Raoult D, et al. Azithromycin inhibits the replication of Zika virus. J Antivirals Antiretrovirals. 2018 10(1):6-11. doi: 10.4172/1948-5964.1000173.
[23] Bacharier LB, Guilbert TW, Mauger DT, Boehmer S, Beigelman A, Fitzpatrick AM, et al. Early administration of azithromycin and prevention of severe lower respiratory tract illnesses in preschool children with a history of such illnesses: A randomized clinical trial. JAMA. 2015 Nov 17;314(19):2034-2044. doi: 10.1001/jama.2015.13896.